CF™染料是Biotium推出的下一代荧光染料，与Alexa Fluor®、DyLight®、Cy®染料和IRDye®等其他染料相比，它在亮度、光稳定性和水溶性方面具有综合优势。CF染料dUTP可用于TUNEL染色，也可以替代标准DNA标记和合成协议中的dTTP，以生成荧光双链DNA和寡核苷酸探针。
注意：CF™405S-dUTP可能不适用于组织的TUNEL染色，因为组织中存在蓝光自发荧光，且与其他CF™染料dUTP偶联物相比，在组织切片中的掺入效率较低。同样，CF™680R-dUTP已在细胞的TUNEL染色中进行了测试，但在组织切片中可能无法高效掺入。
注意：对于PCR应用，应使用Taq聚合酶与dUTP偶联物配合使用，因为dUTP会抑制古菌聚合酶，例如Pfu和Vent®。
1. Gold et al. (1994). Lab Invest. 71 (2):219-25.
2. Slupphaug et al. (1993). Anal Biochem. 211 (1):164-9.
3. Hogrefe et al. (2002). PNAS 99 (2): 596–601.
CF 488 A-dUTP可用于TUNEL测定，或合成用于原位杂交和核酸印迹应用的标记的DNA探针。CF®染料是Biotium的下一代荧光染料，与其他荧光染料相比，具有亮度，光稳定性和共轭特异性的优势。绿色荧光CF®488 A染料在490/515 nm处具有激发/发射。
艾美捷CF488 A-dUTP,冻干粉（BTM-40008）特点：
1、合成异常明亮和光稳定的荧光 DNA 探针
2、通过荧光显微镜、流式细胞仪或凝胶检测
3、与固定细胞或组织切片兼容
4、可选择 8 种 CF® 染料颜色，从蓝色到近红外
细胞凋亡的末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）
注：Biotium还提供多种颜色的CF染料TUNEL检测试剂盒，包含平衡缓冲液、CF染料TUNEL反应缓冲液和TdT酶。
1. 需要但未提供的材料
- 磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）
- 4%甲醛/PBS
- 70%乙醇（可选）
- PBS/0.2%Triton™ X-100
- PBS/0.1%Triton™ X-100/5 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）
- 12.5 U/μL重组末端转移酶（TdT）酶
- 5×TdT反应缓冲液：1 M重铬酸钾，125 mM Tris-HCl，1.25 mg/mL BSA，pH 6.6
- 25 mM CoCl₂溶液
- 100 mM dATP
2. 样本制备
2.1 细胞或新鲜冷冻组织切片的制备
a) 可选：额外准备一份样本用于无TdT酶的阴性对照TUNEL反应。
b) 用PBS洗涤细胞或切片两次。
c) 在4%甲醛/PBS中固定样本，4℃下孵育30分钟。
d) 用PBS洗涤两次。
e) 可选：将细胞保存于70%乙醇中，-20℃下可保存长达两周。
f) 在0.2% Triton™ X-100的PBS中通透处理30分钟，室温下进行。
g) 用PBS洗涤两次。
2.2 石蜡组织切片的制备
a) 可选：额外准备一份样本用于无TdT酶的阴性对照TUNEL标记。
b) 按照标准方法脱蜡和水化切片。
c) 用PBS洗涤两次。
d) 用20 mg/mL蛋白酶K的PBS溶液在37℃下孵育切片30分钟进行通透处理。根据组织类型，蛋白酶K的孵育时间和温度可能需要优化。或者，也可以在此步骤使用微波抗原修复方法。
e) 用PBS多次洗涤。
3. 反应混合液的制备
3.1 将CF染料-dUTP稀释至10 μM，溶剂为去离子水。
3.2 每份样本准备100 μL TUNEL平衡缓冲液：
- 20 μL 5×TdT反应缓冲液
- 20 μL 25 mM CoCl₂
- 60 μL去离子水
3.3 每份样本准备50 μL CF染料TUNEL反应混合液：
| 组分 | 每次反应的体积 | 最终浓度 |
| 5×TdT反应缓冲液 | 10 μL | 1× |
| 25 mM CoCl₂ | 10 μL | 5 mM |
| 100 μM dATP | 2.5 μL | 5 μM |
| 10 μM CF染料-dUTP | 2.5 μL | 0.5 μM |
| 12.5 U/μL TdT酶 | 1 μL | 12.5 U/反应 |
| 去离子水 | 24 μL | |
| 最终体积 | 50 μL | |
可选：准备一份不含TdT酶的阴性对照样本。
4. TUNEL染色
4.1 用100 μL平衡缓冲液在室温下孵育样本5分钟。
a) 对于贴壁细胞或组织切片，覆盖一层Parafilm®盖玻片，使缓冲液均匀覆盖细胞或组织切片。
4.2 移除平衡缓冲液，并向每份样本中加入50 μL反应缓冲液。
a) 对于贴壁细胞或组织切片，覆盖一层Parafilm®盖玻片，使缓冲液均匀覆盖细胞或组织切片。
4.3 在37℃下孵育样本60分钟，避光。组织切片可能需要在37℃下孵育2小时。
a) 对于贴壁细胞或组织切片，在湿盒中进行孵育。
b) 对于悬浮细胞，在微孔板上使用摇床孵育，或者每隔15分钟轻轻敲击试管，使细胞重新悬浮于反应缓冲液中。
4.4 用PBS/0.1% Triton X-100/5 mg/mL BSA洗涤样本，每次5分钟，重复3次。
4.5 如有需要，对样本进行复染。将样本封片在荧光封片剂中，并盖上盖玻片进行显微镜观察，或者通过流式细胞术分析悬浮细胞。TUNEL阳性的细胞应显示明亮的核荧光。在没有TdT酶的情况下，不应观察到染色。
