夹心TR-FRET免疫测定法用于半定量检测细胞裂解物中的磷酸化AKT 1/2/3（T308）。完整的分析验证可以在技术数据表中找到。详细的检测方案在通用用户手册中进行了描述。
艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸化AKT泛抗体(T308)TR-FRET细胞信号检测试剂盒组分：
Eu-磷酸化AKT T308抗体（5 µL）
Acc-磷酸化AKT T308抗体（20 µL）
AKT对照裂解液（100 µL）
5倍浓缩裂解缓冲液1（1 mL）
10倍浓缩TR-FRET检测缓冲液（50 µL）
100倍浓缩磷酸酶抑制剂混合液（50 µL）
THUNDER磷酸化AKT泛抗体(T308)TR-FRET细胞信号检测试剂盒(#KIT-AKTT308P-100)配套试剂：
THUNDER™ AKT泛抗体对照裂解液
THUNDER™裂解缓冲液1（5倍浓缩）
THUNDER™ TR-FRET检测缓冲液（10倍浓缩）
THUNDER磷酸化AKT泛抗体(T308)TR-FRET细胞信号检测试剂盒检测原理：
磷酸化AKT泛抗体（T308）检测试剂盒是一种均相时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）夹心免疫检测法。THUNDER™细胞信号检测试验流程包括3个步骤。在细胞处理后，首先使用试剂盒中提供的特定裂解缓冲液将细胞裂解。然后，通过一对荧光标记的抗体以简单的“加入-孵育-测量”格式（单步试剂添加；无需洗涤步骤）检测细胞裂解液中的磷酸化AKT泛抗体（T308）。其中一个抗体标记有供体荧光团（铕螯合物；Eu-Ab1），另一个抗体标记有远红接受体荧光团（FRAb2）。两种标记抗体结合到目标蛋白上不同的表位，使两种染料靠近。使用闪光灯（320或340 nm）或激光（337 nm）激发供体铕螯合物分子时，会触发从供体到接受体分子的FRET，接受体分子随后在665 nm处发射TR-FRET信号。铕螯合物的剩余能量在615 nm处产生光。665 nm处的信号与细胞裂解液中磷酸化AKT泛抗体（T308）的浓度成正比。数据可以表示为665 nm处的信号，或665 nm/615 nm的比值。
验证数据：
该检测试剂盒已通过双板检测协议，验证用于NIH3T3细胞裂解液中磷酸化AKT泛抗体（T308）的相对定量检测。
采用贴壁培养方式，细胞在96孔细胞培养板中培养48小时（培养基为DMEM + 10% CBS）。
细胞处理后，移除培养基，使用1X裂解缓冲液1（50 µL）裂解细胞，该缓冲液中添加了磷酸酶抑制剂（1 mM氟化钠和2 mM焦磷酸钠）。
在室温下于振荡器（400 rpm）上孵育30分钟后，将裂解液（15 µL）转移至384孔检测板中，并加入标记抗体Eu-Ab1和FR-Ab2（5 µL），用于检测磷酸化AKT泛抗体（T308）。
在室温下孵育4小时后，使用EnVision®仪器（闪光灯激发）记录665 nm和615 nm处的TR-FRET信号。
艾美捷科技是BioAuxilium的中国区域合作伙伴，为科研工作者提供优质的产品与服务。
