胰蛋白酶是一种由胰腺产生的丝氨酸蛋白酶，以无活性的前体酶形式存在。它被分泌到小肠中，通过肠激酶激活。胰蛋白酶倾向于在肽链中碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸）的羧基侧进行切割。胰蛋白酶在多种生物技术应用中被使用，例如细胞和组织培养、肽序列分析以及细胞分离。AkrivisBio的胰蛋白酶检测是一种动力学检测，使用胰蛋白酶底物（GPK-pNA）。当被胰蛋白酶切割时，释放出的对硝基苯胺（p-NA）具有强烈的颜色，更大吸收波长为405纳米，这使得检测能够检测到低至每样本0.05-0.1mU的胰蛋白酶活性。
艾美捷胰蛋白酶活性测定试剂盒：
货号：MA-0128
规格：100孔
样本类型：血清、血浆、细胞裂解液、组织提取液、尿液、细胞培养基
适用物种：通用（适用于所有物种）
检测方法：比色法，检测波长405纳米
检测类型：定量
应用：基于微孔板的比色法检测，用于定量检测广泛样本中的胰蛋白酶活性。
灵敏度：0.05-0.1mU
储存条件：4°C
运输条件：凝胶冷藏包
胰蛋白酶活性测定试剂盒检测组分：
-检测缓冲液：25毫升，货号WMMA-0128-A
-GPK-pNA溶液：200微升，红色，货号MA-0128-B
-胰蛋白酶阳性对照：冻干粉，蓝色，货号MA-1028-C
-p-NA标准品（0.8mM）：400微升，黄色，货号MA-1028-D
-胰蛋白酶抑制剂：100微升，紫色，货号MA-0128-E
-胰凝乳蛋白酶抑制剂：100微升，白色，货号MA-0128-F
胰蛋白酶活性测定试剂盒检测原理：
1.胰蛋白酶切割GPK-pNA，释放出游离的p-NA到溶液中。
2.通过吸光度测定p-NA含量，其消光系数为6.993mM⁻¹cm⁻¹。
储存和处理：
储存于4°C。打开试剂瓶前请短暂离心。使用前将所有组分恢复至室温。
-GPK-pNA、p-NA标准品、胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂：直接使用。
-胰蛋白酶阳性对照：用100微升检测缓冲液溶解。如果需要在一段时间内反复使用该试剂，建议将酶分装成小份量并储存于-20°C。
检测步骤：
1.标准曲线制备：将0、5、10、15、20、25微升的p-NA标准品分别转移至96孔板的多个孔中。用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升，得到0、4、8、12、16和20纳摩尔/孔的p-NA标准系列。
2.阳性对照：将5微升阳性对照转移至95微升去离子水中。将5微升阳性对照加入到成对的孔中，用检测缓冲液将体积调整至每孔50微升。向其中一个孔中加入1微升胰蛋白酶抑制剂，并预孵育5分钟，作为胰蛋白酶抑制剂对照。
3.样本准备和使用：用100微升检测缓冲液提取组织（10毫克）或细胞（1×10⁶），以16,000×g离心5分钟。将20-50微升样本转移至96孔板中，并用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。对于血清样本，加入50微升至样本孔中。重要的是，未知样本的读数应在标准曲线范围内。如果任何样本超出此范围，请适当稀释并重新运行。通过用1微升胰凝乳蛋白酶抑制剂（TPCK）溶液处理成对的样本，并在加入GPK-pNA开始反应前预孵育10分钟，校正非胰蛋白酶活性。
4.启动反应：每个反应需要50微升反应混合液。
5.测量：在室温下，以405纳米的波长在动力学模式下监测所有孔，最长可达2小时。如果活性较低，可以延长监测时间。
-注意：这是一种动力学检测，通过吸光度随时间的变化率来确定反应速率，该速率与孔中活性胰蛋白酶的量成正比。应检查数据以确定测量中与时间呈线性变化的部分。
6.典型结果：
7.计算：
-从所有其他标准品中减去0标准品的读数。绘制p-NA标准曲线并确定斜率（OD/纳摩尔）。对于所有其他孔，确定每个反应的线性斜率（OD/分钟）。将每个反应速率除以标准曲线的斜率，以确定每个阳性对照、测试样本和抑制剂对照孔中的胰蛋白酶活性（OD/分钟）/（OD/纳摩尔）=（纳摩尔/分钟或mU）。
-按照以下方法将该值转换为每样本的胰蛋白酶活性：
-A.孔中的mU/加入孔中的样本微升数=每微升样本的胰蛋白酶活性（mU）
-B.每微升样本的胰蛋白酶活性（mU）×样本体积（微升）=每样本的总mU
-C.每样本的总mU/毫克组织（或细胞数量或血清微升数）=每毫克（或细胞数量或血清微升数）的mU
