一、细胞裂解技术方案
（一）单层贴壁细胞裂解流程
细胞洗涤预处理
弃去细胞培养液，使用 7ml 预冷（冰浴）的无钙镁离子 PBS 缓冲液轻柔冲洗培养皿单层细胞，重复洗涤 1 次
洗涤完成后立即将培养皿置于冰上或冰盘铝板上维持低温环境
裂解液添加与作用
向 90mm 直径培养皿中加入 0.5ml RNA 提取缓冲液，倾斜培养皿使裂解液均匀覆盖细胞单层RNA 提取缓冲液配方（pH8.6）
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl₂
10mmol/L Tris-Cl
0.5% NP-40
1mmol/L DTT
100U/ml 胎盘 RNA 酶抑制剂（或 20mmol/L 氧钒核糖核苷复合物）
蛋白酶消化体系构建
加入 0.5ml 蛋白酶消化缓冲液，用细胞刮棒将粘稠裂解物刮取混匀并集中至培养皿边缘蛋白酶消化缓冲液配方（pH8.0）
0.2mol/L Tris-Cl
25mmol/L EDTA
0.3mol/L NaCl
2% SDS
DNA 剪切处理
使用 21 号针头注射器反复抽吸 - 注入裂解物 3-4 次，直至裂解物粘度明显降低
酶消化反应
加入 20mg/ml 蛋白酶 K 贮存液，使终浓度达 200μg/ml，充分混匀后 37℃水浴孵育 30 分钟
（二）悬浮细胞 / 单细胞悬液裂解流程
细胞收集与洗涤
4℃条件下 2000g 离心 5 分钟收集细胞，弃上清
用 10 倍体积预冷无钙镁 PBS 重悬细胞沉淀，采用大口径吸管轻柔吹打至完全分散，重复洗涤 3 次
裂解体系制备
准确估计细胞沉淀体积，加入 10-20 倍体积 RNA 提取缓冲液（配方同前），轻柔吹打混匀细胞悬液
消化体系构建与 DNA 剪切
加入等体积蛋白酶消化缓冲液（配方同前），立即涡旋振荡混匀
参照贴壁细胞处理方法，使用 21 号针头注射器进行 3-4 次抽吸 - 注入操作剪切 DNA
酶消化反应
加入 20mg/ml 蛋白酶 K 贮存液（终浓度 200μg/ml），充分混匀后 37℃水浴孵育 30 分钟
关键技术参数说明
温度控制：所有洗涤及裂解步骤需在 4℃或冰浴条件下进行，抑制 RNA 酶活性
DNA 剪切：注射器抽吸操作需确保裂解物充分剪切，避免基因组 DNA 污染
试剂保存：RNA 酶抑制剂需分装冻存（-20℃），避免反复冻融；蛋白酶 K 贮存液建议小剂量分装保存
注意事项
悬浮细胞洗涤时应使用大口径吸管，避免机械损伤细胞
裂解液覆盖贴壁细胞时需缓慢加入，确保均匀裂解
酶消化过程中可每隔 10 分钟轻柔颠倒混匀，保证反应充分
本规程适用于哺乳动物细胞总 RNA 的高效分离，可有效保持 RNA 完整性，为后续 RT-PCR、Northern blot 等分子生物学实验提供优质样本，关于产品的购买请咨询艾美捷科技。
