（一）核心技术参数

（二）性能验证数据

1. 线性关系：通过系列稀释标准品，pTau181 和 pTau217 均获得 R²>0.99 的标准曲线，显示优异的线性关系。

2. 回收率测试：在 CSF 中添加标准品，回收率范围 95%-105%（均值 101%），证明检测准确性。

3. 精密度：板内变异系数（CV）<7%，板间 CV<9%，确保结果重复性。

（三）技术优势解析

1. 双抗体夹心技术：试剂盒采用预包被的抗 pTau 捕获抗体和生物素化检测抗体，特异性识别特定磷酸化位点（如 pTau181、pTau217），避免与总 Tau 或其他磷酸化位点的交叉反应。

2. 高灵敏度设计：检测下限达 pg/mL 级，可有效区分健康人群（CSF pTau181 约 150-300 pg/mL）与 AD 患者（CSF pTau181>450 pg/mL）的微小变化。

3. 标准化流程：12×8 孔可拆卸板条设计，支持单次检测 8-96 个样本，适配不同实验规模需求；全程操作仅需 16 小时（含过夜孵育），减少实验耗时。

4. 样本兼容性：专为人 CSF 样本优化，避免血液成分干扰，同时兼容大鼠、猕猴等动物模型样本，为基础研究提供便利。

三、检测原理与实验流程

（一）检测原理

1. 捕获阶段：预包被于微孔板的抗 pTau 抗体特异性结合样本中的 pTau 分子；

2. 信号放大：生物素化检测抗体与捕获的 pTau 结合，随后加入链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶（HRP）复合物，形成 “抗体 - pTau - 生物素抗体 - HRP” 复合物；

3. 显色反应：加入 TMB 底物后，HRP 催化底物显色，颜色深浅与样本中 pTau 浓度成正比；

4. 定量分析：通过酶标仪检测 450 nm 吸光度，根据标准曲线计算样本中 pTau 含量。

（二）实验流程概述

1. 样本预处理：

• CSF 采集：采用腰椎穿刺获取 CSF，离心（3,000 rpm，10 分钟）去除细胞碎片，避免溶血；

• 样本保存：CSF 可在 - 80℃保存，避免反复冻融；

• 稀释要求：样本需按 1:100 稀释后加入孔板，确保检测在标准曲线范围内。

2. 加样与孵育：

• 标准品和样本按 1:100 稀释后加入孔板，4℃过夜孵育；

• 依次加入生物素化抗体（37℃孵育 30 分钟）和 HRP 复合物（室温孵育 30 分钟），每次孵育后需彻底洗涤以去除未结合成分。

3. 显色与检测：

• TMB 底物避光显色 15-20 分钟，草酸终止反应；

• 酶标仪读取 450 nm 吸光度，扣除 540 nm 背景值后计算结果。

（三）关键注意事项

1. 样本处理：

• 溶血样本可能释放内源性过氧化物酶，干扰检测结果；

• 脂血样本需超速离心（10,000 rpm，30 分钟）去除脂质颗粒。

2. 温育条件：严格控制孵育温度和时间，避免温度波动影响抗体 - 抗原结合效率。

3. 洗涤步骤：使用试剂盒配套洗涤液，每孔洗涤 5 次，每次浸泡 1 分钟，确保彻底去除未结合成分。

4. 安全防护：TMB 底物具有潜在致癌性，需戴手套操作；终止液草酸需避免接触皮肤与黏膜。

四、应用领域与研究价值

（一）临床诊断与监测

1. 阿尔茨海默病（AD）：

• 早期诊断：CSF pTau181 结合 Aβ42/Aβ40 比率可提高 AD 诊断特异性（AUC=0.89）；血浆 pTau217 在无症状 AD 风险人群中升高早于神经退行性改变，辅助早期筛查。

• 病情监测：动态监测 pTau 水平可评估疾病进展及药物疗效，如抗 Tau 抗体治疗临床试验中，pTau 下降与临床症状改善呈正相关。

2. 其他 tauopathies：

• 额颞叶痴呆（FTD）：CSF pTau 水平显著低于 AD，结合 pTau181/pTau217 比值可辅助鉴别诊断。

• 进行性核上性麻痹（PSP）：CSF pTau 水平升高，与疾病严重程度及生存期相关。

3. 药物研发评价：

• 评估抗 Tau 药物（如 Tau 聚集抑制剂）的药效，监测治疗过程中 pTau 水平的动态变化；

• 在血脑屏障通透性研究中，结合血浆 pTau 检测可评估药物脑内递送效率。

（二）基础研究应用

1. 神经损伤机制研究：

• 通过检测 pTau 生成量，解析不同损伤模型（如氧化应激、缺血再灌注）中轴突损伤的分子机制；

• 研究 Tau 蛋白与其他神经退行性标志物（如 α-synuclein、TDP-43）的相互作用网络。

2. 动物模型研究：

• 构建 hTau 转基因小鼠模型，研究 Tau 聚集与神经退行性变的因果关系；

• 模拟 AD 病理过程中，分析 pTau 水平变化对突触可塑性及线粒体功能的影响。

3. 新型生物标志物开发：

• 结合质谱技术，鉴定 Tau 蛋白的翻译后修饰（如多巴胺化、泛素化），探索其与疾病进展的关联；

• 开发血浆 pTau 检测方法，推动非侵入性 AD 筛查技术的临床转化。

五、质量控制与结果解读

（一）室内质量控制

1. 标准品验证：每次实验需包含标准品曲线，确保标准品吸光度值在试剂盒提供的范围内。

2. 阴性对照：使用试剂盒提供的阴性对照 CSF，其 OD 值应低于临界值（通常为 0.1）。

3. 重复性检测：对同一样本进行重复检测，确保 CV<10%，否则需重新实验。

（二）结果解读要点

1. 生理波动：CSF pTau 水平受年龄、性别、肾功能等因素影响，需结合临床背景综合分析。例如，老年人 CSF pTau 水平轻度升高可能与生理性神经退变相关。

2. 疾病特异性：pTau 升高可见于多种神经退行性疾病，需结合其他指标（如 Aβ42、总 Tau）及影像学结果进行鉴别诊断。例如，AD 患者表现为 CSF pTau 升高伴 Aβ42 降低，而 FTD 患者 pTau 水平正常或轻度升高。

3. 动态监测：单次检测结果需结合临床症状及其他标志物（如血浆 GFAP、CSF pTau217）进行动态评估。例如，在抗 Tau 药物临床试验中，pTau 水平下降需持续 6 个月以上方可视为治疗有效。

六、总结与展望

1. IBL America. Phospho-Tau (Human) ELISA Kit Product Manual. 2025.
2. Kawarabayashi T, et al. Clinical evaluation of cerebrospinal fluid p217tau and neurofilament light chain levels in patients with Alzheimer's disease or other neurological diseases. J Alzheimers Dis. 2023;96(4):1623-1638.
3. Hampel H, et al. Total and phosphorylated tau protein as biological markers of Alzheimer's disease. Exp Gerontol. 2010.
4. De Meyer S, et al. Comparison of ELISA- and SIMOA-based quantification of plasma Aβ ratios for early detection of cerebral amyloidosis. Alzheimer's Res Ther. 2020.
5. Villeneuve S, et al. Plasma p-tau217 predicts future cognitive decline in cognitively unimpaired individuals. Alzheimer's Dement. 2025.
6. Zhang L, et al. Ultrasensitive and point-of-care detection of plasma phosphorylated tau in Alzheimer’s disease using colorimetric and surface-enhanced Raman scattering dual-readout lateral flow assay. Nano Res. 2023;16(5):7459-7469.
7. Bayoumy S, et al. Clinical and analytical comparison of six Simoa assays for plasma P-tau isoforms P-tau181, P-tau217, and P-tau231. Alzheimer's Res Ther. 2021;13:198.
8. UmanDiagnostics. NF-light® ELISA Product Manual. 2025.
9. Cleveland Clinic. Neurofilament Light Chain Fact Sheet. 2024.
10. National Science and Technology Library. Multi-center validation study of NF-light ELISA. 2024.